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半夏>>半夏的组织培养(一)>>基本设备 |
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半夏是一味常用中药，由于种种原因其野生资源供不应求，人工栽培因繁殖力低及品种退化等问题限制了产量和质量的提高。为了改变这些现状，可应用现代生物学手段对其进行组织培养，一方面可以建立半夏无性系快速繁殖系统，提高其繁殖系数；另一方面可以筛选出具有优良性状的半夏品种。 |
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一、准备室
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要求20平方米左右，明亮，通风。准备室的任务很繁重，要完成器皿洗涤，培养基配制、分装、包扎、高压灭菌等环节，同时兼顾试管苗出瓶、清洗与整理工作，如果房间较多，可将试管苗出瓶与培养器皿的洗涤单分出在另一间室内进行。生产条件下，本室的工作可由1-2名熟练工人承担。本室的主要设备及用具有：
1. 100-200升电冰箱 用以贮存易变质、易分解药品及各种母液。
2. 高压灭菌锅 若选用手提式需2-3个；使用中型立式只需1个，或再配一个手提式更方便。手提式方便、快捷，但连续大规模使用效率不高。如年产百万株苗，则应选大型卧式。
3.
配合灭菌锅的电炉或煤气炉 手提式灭菌锅宜配用2-2.5千瓦的电炉。
4. 4-6升的不锈钢锅 最适合用的是电饭锅，煮制琼脂培养基很相宜，也可用一铝锅。配用1500W或200W电炉，安装闸刀式开关，比较方便、安全和耐用。
5.洗涤用水槽 1-2个。水槽应较大，最好是内衬白瓷砖的水泥槽，为防止培养皿碰坏，可铺一活动的橡胶板。附有上下水道。
6.大型工作台1-2张，大桌子1-2张。
7.玻璃橱1个，搁架2-3个，用以放置药品、培养瓶等物品。
8.干燥箱(小、中型)1个，用于棉塞、器皿等干热灭菌，器皿等烘干。在烘烤棉塞等易燃物品时，应有专人守候，防止着火。
9.无离子水发生器或蒸馏水发生器1套。
10.半导体小型酸度测定仪或其它酸度计、pH计等。实际在生产条件下用精密pH试纸测试和调整pH值即可。
11.称量500克、感量0.1克普通天平1架，称量为100克或200克、感量0.01克工业天平1架。
12.培养器皿 工作中使用大量的培养容器，主要根据培养物的生长情况来选用适当形状和大小的容器，以工作方便为原则，并没有太严格的要求。如各种规格的试管，通常以口径20-30毫米，长度以100、150、200毫米的平底试管较为常用。容量50-300毫升的三角烧瓶也较常用。另外可去废品公司寻找规格划一，数量较大的各种回收瓶子，其中有非常令人满意的代用品。有的还带有塑料或金属的旋盖。最好瓶口宽大，操作较方便，又可叠摞起来，起初可买少量来试用，合乎要求再大量买回。要注意代用瓶是否耐冷热骤变，是否耐高压消毒，透明度如何，瓶盖是否耐高压灭菌，有无有毒物质溶出或以气体形态危害培养物等等，如不合用则立即淘汰。从废品公司买回的瓶子，第一次洗涤要特别仔细，以免带入有害物质。回收的罐头瓶子价格低廉，由于需用量大，在投资并不充裕时，可选用。罐头瓶瓶壁都比三角烧瓶厚实，洗涤时损坏率较小。四壁厚，在高压灭菌时应适当延长灭菌时间。通常为避免培养基中成分损失，多延长不加压的煮沸时间，使充分预热升温，而加压的时间仍按常规较好。在使用几乎全密闭的瓶盖，如聚丙烯或尼龙盖、铁盖、绑扎的聚丙烯薄膜盖时，往往按正常的灭菌操作不能彻底灭菌，培养基会自动大量污染，造成工作中的严重损失。这是因为高压的热蒸汽不能自由地进入瓶内空间，瓶内的冷空气不能迅速被热蒸汽取代，升温缓慢，在限定的15-20分钟内难以升到120℃的温度，或升到120℃但没有保持到15-20分钟，因而不能彻底灭菌。如果密闭得紧，那么瓶内空间不可能获得如灭菌锅的蒸汽压力表上所指示的压力和温度，当然难以杀灭造成污染的微生物了。解决这一问题的办法很简单，即在灭菌前不要把盖完全拧紧，在绑扎薄膜盖前衬垫一小块纱布，以使瓶内外冷热空气和压力得以交流和平衡。在灭菌后及时旋紧瓶盖，而在接种后弃去衬垫的小纱布(可反复使用)。有报告指出，钠玻璃瓶对某些植物组织有毒性，尤其是在多次高压灭菌后使用，因此，在做研究工作时要采用硼硅酸盐玻璃瓶或硬质玻璃瓶。目前，国外已逐渐改用耐高温的聚丙烯塑料容器，通常使用一次即弃去，既节省洗涤人工，又提高效率。在我国，用于组织培养的塑料制品已引起有关部门的重视，新产品即将陆续面市。塑料容器大多有理想的使用效果，质轻，透明，不易破碎，多为平底长方盒形，不但培养的植株数多，而且能一层层地叠摞起来，节约空间。容器的数量取决于生产规模，主要是无菌操作工人人数、每天工作数量和所生产的植物需要培养的天数，即培养周期。
13.分装培养基的器具 曾见到一些生产单位，也有科研单位使用漏斗作为分装培养基的工具，培养容器全面铺开，用勺通过漏斗将热的培养基分到一个个的培养容器中，这在大量生产时颇不方便，效率不高。简单而又方便的方法是在医疗器械商店里买的“下口杯”，又叫“吊桶”，在下口管上套一段软胶管，加一弹簧夹即可。用于生产与实验，有2000毫升和100毫升的各2个，就够用了。下口杯还用于培养基煮好后确定其体积。考虑到培养基在定容时的温度多在80℃-90℃以上，因此确定的体积应高于它在常温(20℃)时的体积。这个环节的数量关系，各个实验室几乎都靠估计来补充培养基在煮制过程中蒸发掉的水分，一般1000毫升的热培养基，定容为1100毫升，这在培养基冷却到室温时，接近1000毫升。
14.试剂瓶1000毫升、500毫升、250毫升，棕色、白色各5个，100毫升滴瓶10个，100毫升试剂瓶20个。
15.移液管10毫升、5毫升、2毫升、1毫升各5支。
16.量筒1000毫升、500毫升各2只，100毫升、50毫升、10毫升各4只。
17.烧杯1000毫升、500毫升、250毫升、150毫升、100毫升各10只。
18.容量瓶1000毫升、500毫升、250毫升、100毫升各4只。如果不做研究，只做快速繁殖生产，用量筒代替容量瓶也可满足需要。
19.各式洗瓶刷若干只。
20.胶手套和线手套若干双，用于洗涤和拿取高压灭菌后热的培养瓶等。
21.大型的塑料果菜篮20个，洗涤后或未洗的培养容器应比较集中地堆放起来，避免占地太多，影响工作。最好用的就是塑料果菜篮，过去有些实验室使用定做的铁丝筐，因易生锈，并不理想。竹制小筐篮虽可选用，但因其易积藏灰尘、污物，沾水后不易干，常从筐下渗滴污水，也不理想。摆满培养容器的果菜篮再放到搁架上，显得井井有条。其余物品可视工作需要而添置。
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二、无菌操作室(接种室)
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如果说准备室因工作内容多，处理事物的数量大，在条件许可时面积宜大不宜小，那么无菌操作室却恰好相反了，即在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，忌粗陋放散。无菌操作室也叫接种室，是进行无菌工作的场所，如材料的消毒接种，无菌材料的继代，如丛生苗的增殖或切割嫩茎插植生根等等。这里是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分，关系到培养物的污染率、接种工作效率等重要指标，要求地面、天花板及四壁尽可能光洁，不易积染灰尘，易于采取各种清洁和消毒措施。可采用水磨石地面或水磨石砌块地面，白瓷砖墙面或防菌漆墙面，防菌漆天花板板面等结构。如只放置1台超净台，约7-8m2，2台超净台10-12m2即足够了。无菌室要干爽安静、清洁明亮，在适当的位置吊装紫外线灭菌灯1-2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。最好安置一小型空气温度调节器(即空调机)，在使用时开启机器，使室温保持在26℃左右，这样就可以在工作时或不工作时都把无菌室的门窗紧闭，保持与外界相对隔绝的状态，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入，加之经常采用消毒措施，就可以达到较高的无菌水平，以利安全操作，提高工作的质量与效率。无菌室配置拉门，以减少空气的流动。无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋，洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等。缓冲间最好安一盏紫外线灯，用以灭菌。缓冲间面积2m2多就可以了，有一个洗手池，上面安一小搁架，用来放置烧杯、采回的材料等物。墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋或设一鞋箱(小盒)。无菌室内的主要设备为超净工作台1-2台，放置待接种培养瓶的搁架，医用小平车，用来推送接种好了的培养瓶等。
1.超净台 在投资少的情况下，可以用接种箱代替超净台。接种箱的历史至少超过1个世纪，只是近一二十年才由超净台取代了它。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外线灯照射等双重灭菌来保证内部空间无菌，无菌状态良好。接种箱的缺点是操作活动受限制，欠自如，工作效率较低，需要较长时间的准备，不利于长时间操作，以及有些人对熏蒸药剂敏感，而不能使用等等。接种箱也可以自行仿制，目前也有许多厂家能够提供很漂亮的有机玻璃做的接种箱。
把接种箱的空间扩大，人可进入室内操作，而不只是伸手入内操作，便是无菌室(不使用超净台和接种箱)，它的灭菌原理同接种箱一样，操作却很方便，但由于人的呼吸和不断地活动，使用时间不可太长，否则污染严重。
目前大多数工作单位都是把超净台安放在无菌室内，可见操作质量要高得多了。超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，预备时间短，开机10分钟以上即可操作，基本上可随时使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台由三相电机作鼓风动力，功率145-260W左右，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3微米的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为24-30m/分钟，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作，保持无菌材料在转移接种过程中不受污染。但是万一操作中途遇到停电，暴露在未过滤空气中的材料便难以幸免污染。这时应迅速结束工作，并在瓶上作出记号，内中的材料如处于增殖阶段，则以后不再用作增殖而转入生根培养。如为一般性生产材料，因极其丰富也可弃去。如处于生根过程，则可留待以后种植用。
超净台电源多采用三相四线制，其中有一零线，连通机器外壳，应接牢在地线上，另外三线都是相线，工作电压是380V。三线接入电路中有一定的顺序，如线头接错了，风机会反转，这时声音正常或稍不正常，超净台正面无风(可用酒精灯火焰观察动静，不宜久试)，应及时切断电源，只要将其中任何两相的线头交换一下位置再接上，就可解决。三相线如只接入两相，或三相中有一相接触不良，则机器声音很不正常，应立即切断电源仔细检修，否则会烧毁电机。这些常识应在开始使用超净台时就向工作人员讲解清楚，免除不应造成的事故与损失。
超净台进风口在背面或正面的下方，金属网罩内有一普通泡沫塑料片或无纺布，用以阻拦大颗粒尘埃，应常检查、拆洗，如发现泡沫塑料老化，要及时更换。除进风口以外，如有漏气孔隙，应当堵严，如贴胶布，塞棉花，贴胶水纸等。工作台正面的金属网罩内是超级滤清器，超级滤清器也可更换，如因使用年久，尘粒堵塞，风速减小，不能保证无菌操作时，则可换上新的。
超净台使用寿命的长短与空气的洁净程度有关。在温带地区超净台可在一般实验室使用，然而在热带或亚热带地区，由于大气中含有高量的花粉，或多粉尘的地区，超净台则宜放在较好的有双道门的室内使用。任何情况下不应将超净台的进风罩对着开敞的门或窗，以免影响滤清器的使用寿命。
无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用2%新洁尔灭抹拭台面和用具(70%酒精也可)，用福尔马林(40%甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启
15分钟以上)等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。接种箱内部也应装有紫外线灯，使用前开灯15分钟以上照射灭菌，但凡是照射不到之处仍是有菌的。在紫外线灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体成分有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十多分钟即可入内。
在超净工作台上亦可吊装紫外线灯，但应装在照明灯罩之外，并错开照明灯平行排列，这样在工作时不妨碍照明。若将紫外线灯装入照明灯罩(玻璃板)里面，这是毫无用处的，因为紫外线不能穿透玻璃，它的灯管是石英玻璃，而不是硅酸盐玻璃制成的。
接种室内力求简洁，凡与本室工作无直接关系的物品一律不能放入，以利保持无菌状态。接种室内的空气与外界空气应绝对隔绝，预留的通气孔道应尽量密闭。通气孔道可设上下气窗，气窗面积宜稍大，需覆上4层纱布作简单滤尘。在一天工作之后，可开窗充分换气，然后再予以密闭。总之，既要清洁无尘无菌，又要空气新鲜，适宜工作。覆在通气窗上的纱布应经常换洗。但是上述种种措施只是理想的设计方案，往往不易全面做到，其实只要严格无菌操作手续，在门窗敞开的室内，有一超净台的保护，接种的污染率仍可控制在生产上可以容忍的水平。
2.小搁架 贮放高压灭菌过、等待接种的培养瓶用的小搁架，一般可设计为高100厘米，宽50厘米，长120厘米，分为4层，每层相间25厘米。用4毫米玻璃作搁板。这架子可以存放许多瓶子，几乎够一个多星期之用。需注意的是刚灭完菌的热瓶子不可直接放到玻璃板上，以防玻璃炸裂，但垫上两层纱布就可有效地防止。纱布和玻璃板都应经常保持清洁。
3.医用小平车 用来推送瓶子，如果没有，也可用大白瓷盘代替。因为组织培养工作每天过手的瓶子数量很大，用小平车可以提高效率。在准备室、接种室、培养室门的设计时，同时应注意不留门坎，而又不妨碍密闭。如果确实需要门坎，应在门坎两侧加护坡，以便小车平稳推送。
4.无菌操作用的器具 按每个超净台上的用量计，需酒精灯1只(另备用1只，如有本生灯只需1只)；25厘米长的镊子2把(备用数把，幼苗出瓶时也需用)；4号解剖刀柄2-4把，21-23号解剖刀片若干；不同形状的解剖用剪各1-2把，如平的、膝状的、弧形的等等。比较长的镊状剪是很好用的，可伸入培养瓶中剪取材料。500毫升广口瓶数只，用于存放酒精(70%或95%均可)，可浸泡镊子、刀、剪等。卧式染片缸或类似的方形玻璃缸1-2个，用于架放灼烧过的刀和镊子。
5.小白瓷圆碟 用于接种时切割整理接种物，采用培养皿，因价高又易被切碎并不好用。白瓷碟就是餐具中的调味碟，价廉物美，正合适。使用前用双层牛皮纸口袋或聚丙烯薄膜包裹，高压灭菌后使用。根据工作规模，其数量约40-80个。为减少污染，每用一瓶接种物后即行更换。在使用宽口容器，材料又无须细切时，也可在容器中切割分离，而省去白瓷碟。
6.适当大小的烧杯或广口瓶、玻璃棒等 用于新采材料的表面灭菌和清洗。
7.常备的消毒灭菌药剂及助剂 如0.1%升汞、吐温、漂白粉精片、肥皂、洗衣粉等。
8.毛刷 用于清洗采回的材料。毛刷应有数种，视材料不同而选取适当大小与软硬的刷子，如洗手刷、牙刷、各号油画笔、毛笔等。
9.无菌水 用1000毫升或500毫升的大三角瓶，盛放2/3体积的自来水，经半小时的高压灭菌后，放凉备用。视消毒材料的多少，每次需用1-2瓶。无菌水存放时间不宜过长，以1-2周较好，时间长了要重新高压灭菌。 |
| 三、培养室 |
整个植物组织培养工作的几个房间，如有可能，应尽量安排在楼层较高处，以利采光，减少尘埃和杂菌污染的机会，此外应考虑清洁、干燥，培养室还要讲究保温隔热。如果是新建筑，专为组织培养设计，培养室为了减少能源消耗，应尽量利用自然光照，最大限度地增加采光面积，除必要的承重结构外，全部安装落地式双层大玻璃窗，并在窗外设置防止阳光直射的半透明瓦楞板，它的宽度、数目应按当地的纬度、日照强度、日照时数等气象因子适当考虑。瓦楞板的倾角最好能够调节，以尽天时地利。
培养室中距窗较远处的培养架应适当安装人工辅助照明的日光灯，光线不足时可以开灯。培养室的四壁可选用白色或浅米黄色防霉油漆、涂料或墙纸等，地面也应选浅色建材，最好是白水泥或白石水磨石面，或同样的磨石砌块，顶部为白色。总之，各处都应增强反光，以提高室内的亮度。
我国大多数地区属大陆性气候，夏热冬冷，而培养室要求常年保持23℃-27℃，因此房屋构造上要做到保温隔热防寒性能良好，做到冬暖夏凉。温度调节常借助空调机，使高温季节降温，低温季节升温。为了节省投资可以买只有降温无升温功能的空调机。在华南等冬暖地区，冬季由辅助照明灯产生的热量即可很容易地维持室温在25℃左右。在我国中部和北部地区冬季需升温时，可以用电炉连接控温仪来解决，这套装置的费用不多。房屋结构良好，无论降温或升温都可有效地节省能源，并易于保持温度的稳定。培养室应设计能有效通风的窗户，定期或需要时加强通风散热，如夏初或秋末一天温度变化很大，即使夏天，有时夜温也还适宜，都可利用通风来调节温度。只要在室内地板稍高处设置进风气窗，在气窗的对侧近天花板处设置排风窗，亦可安装小功率的排风扇，即可利用自然空气温度来调节室内的温度。进风气窗可用2层以上的纱布简单地滤尘。
如果改建原有房舍作培养室，应考虑增加窗户，改为双层窗，内壁加保温隔热层，如加一层纤维板或胶合板，墙与板之间填塞保温物如蛭石、软木砖、泡沫塑料块等。如原有建筑物质量较好，外界温度变化并非太剧烈，也可只钉一层纤维板，留适当的空气层。
培养室内应建适当大小的边台，边台下为贮放备用品的柜子。边台上放置双筒解剖镜、显微镜等检查观察的仪器。备有照明设备，必要时可拍摄培养物的分化与生长状态的照片。培养室内温、湿度比较恒定，可以放一台分析天平，用来称量微量元素、维生素及植物激素等。
培养室的天花板亦应有保温层，地面架设地板，以利保温。至于这些结构应当完善到什么程度，主要根据当地的温度变化情况、投资的多少等来决定。
如果用一间实验室改成接种室和培养室，可以隔成一大间作培养室，一小间作接种室，门口留一个门斗式的小缓冲间。
本室的主要设备与用具有：1.培养架与灯光 培养室是放置培养物的场所，是成千上万幼苗的培育室、生长室。培养室内整齐地安放若干个培养架，其数量多少主要由生产规模来决定，年产4-10万苗需培养架4-6个，年产苗10-20万，约需8-10个。
培养架的高度可以根据培养室的高度来定，以充分利用空间。培养架如采用日光照明，可以不装灯，如果需要人工辅助光照，可在每层架子上安装固定式的或悬挂式的40W日光灯2盏。固定式的整齐美观，但灯座螺钉孔的位置要求严格，稍不合规格就不亮，或拆换困难，固定后不能再调节灯的位置与高度。悬挂式的则比较灵活，容易调节灯的位置与高度，但不够整齐。悬挂式的灯管是挂在一条绷紧的铁丝上。灯管距架子边缘15厘米，两灯之间距离30厘米。每层架可放置100毫升三角瓶8-10行，每行20瓶，总计160-200个瓶子。每盏灯的两侧各2-3行瓶子。据实地测定，在灯管距搁板16厘米处，第一排瓶子前光强度为1400-16001x，第一排瓶子之后光强度为10001x左右，第二排瓶子之后光强度仍有8001x，这对于大多数培养物来说已无问题。某些需强光的植物或研究中需要强光处理的，可将灯放到距搁板5-6厘米处，恰好是三角瓶中部，这时光强度可提高到2400-30001x(每只灯管的亮度不同，新旧程度也影响亮度)，但距灯管太近时，要留心培养物受温度的影响。
由于日光灯镇流器要产生相当大的热量，在南方皆宜放置在室外墙壁上，在北方也可考虑放在培养室内有助提高室温。如果做成可移动的挂板，可以根据需要挂在培养室内或室外，那就很理想了。
培养架所占面积按60厘米×126厘米计为0.7m2，加上管理通道，在12-14m2的室内可安放6个培养架，对于年产4-10万甚至20万苗的小型生产单位已经够用了。
在采用日光为光源或日光并辅助人工光的条件下，培养架都应纵向对着窗户，以避免第一排架光线过强而第二、三排架子光线太弱。纵向排列可使全室光线分布得比较均匀。
2.配电板 在培养室内应安装1-2个配电板，其上设熔断器(俗称保险丝盒)和闸刀开关，用以管理室内的电源。在配电板上设置几个常用的插座也是必要的，如临时用台灯、显微镜灯，临时用电炉以及分析天平用电等。配电板的位置应仔细考虑，以不妨碍工作人员管理培养瓶，又便于控制为原则，通常安置在边台上的墙上较好。
3.石英电力时控器 这是自动开关灯的设备，它里面放一只电池，推动石英钟行走，石英钟的盘面上除刻有时间刻度外，还有一些小卡子，可用螺钉调节固定在某一时刻上。时控器通过交流接触器控制送电或断电，当时控器盘面行走到小卡子固定的时间刻度时，内部的机械装置动作，造成电流的通或断。将石英电力时控器和交流接触器安装在电路里就可以控制每天开灯关灯，也可以每天定时开关几次，例如夏天高温时节，可以在天亮时开灯(提早到四五点钟)，而在中午气温高时关停几个小时，夜里再补充光照几个小时，以降低温度和减轻空调机的负荷。
4.空调机 窗式空调机能有效地调节室温。在室内无热源的情况下，把门窗紧闭，空调机很快就能将室温调节好。1台每小时散热16747-20934J的空调机可以控制20-40m2的房间(视外界温度和房间保温条件、室内空间大小而异)的温度，同时除湿，所以夏天在空调室内很凉爽。但是培养室内有许多灯管，其散发热量亦不容忽视。因此，在夏季想用空调机将室温降到25℃左右，培养室就不要过大，保温密闭等条件要好，尽量利用日光，少开灯，在夜间或凌晨低温时，加强通风，驱除室内淤积的热量等等。购置空调机要注意质量，劣质产品常于使用中烧机并酿致火灾，使研究成果毁于一旦。
空调机应安置在室内较高的位置，以便于排热散凉，使室温均匀。
5.温度湿度计、温度自动记录仪、最高最低温度计等仪器 这些仪表仪器有不少新产品问世。温度湿度都用指针显示出来，一目了然，方便观察记录。可根据工作的需要适当选购。 |
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