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丹参>>组织培养
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丹参的组织培养，包括离体培养克隆增殖丹参试管苗、人工诱导丹参多倍体、利用丹参细胞培养生产活性成分以及农杆菌转化丹参获得再生植物、利用转化的组织和器官培养生产丹参中的活性成分等。由于栽培丹参的生长周期长和有效成分含量低，给临床使用和质量控制带来一定困难；而野生丹参的资源有限，采挖野生丹参破坏自然界的生态平稳。因此利用丹参的组织培养来改良丹参品质、提高丹参产量、离体培养克隆增殖丹参植株以及利用丹参细胞、器官培养直接获得丹参的有效成分，可以快速大量繁殖优良的丹参苗，并有可能直接大规模工业化生产丹参的活性成分，必将从根本上解决当前丹参栽培中面临的问题和丹参的质量控制问题。
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| 丹参的细胞工程 |
(1)离体培养克隆增殖丹参试管苗费 以叶片、叶柄为外植体在MS附加6-BA2毫克/升(以下同)的培养基上形成丛生苗，丛生苗切下在1/2MS培养基上可长出根，发育成完整植株，移栽土中能够成活。1991年，K.Shimomura等报道了丹参组织培养的结果，试管苗移栽大田六个月丹参酮含量高于3-4年生的商品根。蔡朝晖等详细研究了丹参的组织培养，对不同的丹参外植体、基本培养基的选择、不同植物激素配比诱导丛生芽和试管苗的生根进行了试验。结果表明以叶片为外植体，接种在MS附加6-BA 0.5-1培养基上出芽效果较好，无菌芽在1/2MS附加IBA0.2的培养基上生根效果最好，以此可进行丹参试管苗的大量克隆增殖。
具体方法如下：
取丹参种子放在75%乙醇中消毒1分钟，转入2%次氯酸钠中15分钟，无菌水冲洗5次，在1/2MS培养基上无菌萌发，一个月后获得无菌苗。在附加6-BA1毫克/升，IAA 0.5 毫克/升的MS培养基上不断继代保存。取丹参试管苗0.5厘米的节、节间和切成0.5×0.5平方厘米大小的叶片分别接种到附加6-BA1毫克/升和IAA0.5毫克/升，蔗糖3%，pH 5.8的MS、B5、N6、SH四种基本培养基上。将试管苗叶片切成0.5×0.5平方厘米的小块接种到MS附加不同激素的培养基上，进行诱导丛生芽试验。无根试管苗转至1/2MS，附加不同激素的培养基上，诱导生根。每天光照12小时，光强1200Lux，培养温度25±1℃。
丹参节和节间接种到培养基上，几天后，在节上伸出1-2个腋芽，节和节间膨大，10天后，两端长出愈伤组织，以后从愈伤组织上长出芽或丛芽。叶接种到培养基上10天后，皱缩、变厚，从叶缘切口长出愈伤组织。然后，从愈伤组织处长出芽或丛生芽。在有的培养基上，从叶缘处可直接长出丛生芽。使用不同的外植体，其最适的基本培养基有所不同。以节或节间为外植体，尽管都可以长出芽，但进一步产生丛生芽的百分率不高。其中以B5培养基萌发腋芽和产生丛生芽比例较高，效果较好些。如以叶为外植体，则以MS为基本培养基时诱导丛生芽最快，效果最好，可以不经过愈伤组织阶段从叶缘直接长出丛生芽。说明用叶为外植体时采用MS培养基可以达到快速繁殖的目的。
为了探讨叶在MS培养基上诱导丛生芽的最适激素配比，进一步进行了8组细胞分裂素和生长素的配比试验，结果表明，6-BA有明显的诱导出芽效果，而且随着6-BA浓度的增加，诱导出芽的百分率也增加。
其中以不加任何生长素用6-BA 1 毫克/升时，诱导丛生芽百分率最高，为100%，诱导出芽所需天数最短，仅为16天，但是当加有NAA 0.2 毫克/升时，丛芽诱导效果均相应有下降趋势，出芽也延迟了4天，说明NAA不利于芽的产生。NAA有明显的诱导愈伤组织的作用，当NAA浓度增大到1 毫克/升时，它强烈地抑制丛生芽，产生大量愈伤组织。IAA浓度达到1 毫克/升时也有诱导愈伤组织的作用，但效果次于NAA。在MS培养基中添加6-BA 0.5-1毫克/升或再添加0.5 毫克/升以下的IAA均有利于丛生芽的产生，诱导率达95%以上。试管苗转至生根培养基上后，随着IBA、IAA、NAA浓度的增加，它们的生根率都下降，以浓度较低时(0.2 毫克/升)效果较好，但其中只有低浓度的IBA有促进生根的作用，它的生根率为93.1%，其它组都表现出抑制生根的效果。不添加任何生长素也能取得70%左右的生根效果。
对经试管苗生根形成的小植株进行了多次移栽试验，结果表明按如下步骤移栽效果较好，即待试管苗上的根长至1-2 厘米时，打开瓶口，练苗3-5天。用镊子小心地将小植株取出，在温水中将根上的琼脂洗去，栽入经消毒的砂土营养钵中20 d，并喷雾保湿20天。待生根后连营养土移栽在田间。此法的移栽成活率达90%左右。
（2）人工诱导丹参多倍体的研究 高山林等报道在离体培养条件下添加10-50ppm秋水仙碱，是诱发丹参多倍体行之有效的方法，对试管苗根尖染色体显微鉴定确证所获得的多倍体为同源四倍体，3次以上镜检确认为四倍体的试管苗进行了移栽及田间农艺性状初步鉴定和主要化学成分测定。结果表明所获得的四倍体植株均不同程度地表现出多倍体植株的典型特征，主要化学成分含量亦大多高于原植株，可望进一步选育成新品种。经2年田间农艺性状鉴定记载，把多倍体性状特征明显，农艺性状较好的株系升入品系品比试验，小区重复3次，随机排列，做好全面农艺性状鉴定记载和根产量测定。
从建立株系圃开始，从秋天10-11月丹参收获季节挖取各株系根部药材风干备用，精称各株系样品0.5克，加入二氯甲烷-甲醇(8∶2)混合溶剂8毫升，冷浸过夜，于次日超声提取15分钟离心15分钟(3000r/分钟)，残渣用混合溶剂洗涤，合并提取液，定容10毫升，用高效液相色谱法测定3种丹参酮含量。
连续3年田间农艺性状观察记载结果表明，已鉴定确认的多倍体株系均表现出明显的多倍体特征，即根、茎、叶的巨大性，从而验证了根尖染色体显微鉴定的准确性；另一方面根据田间农艺性状鉴定观察，从中选出优良品系61-2-22，该品系表现出生长势旺，叶较宽大，叶片粗糙皱折，较厚，茎较粗呈淡紫色，育性低，部分不育，根系较粗但分枝多，呈紫红色。经对所获得的多倍体株系进行丹参酮、丹参酮ⅡA及隐丹参酮含量测定结果表明，2261-2-22在
连续3年测定中，3种丹参酮含量均明显高于原二倍体株及其他四倍体株系，其中丹参酮平均含量为0.5013%，比原植株0.1653%高203.26%；丹参酮ⅠA平均含量为93%，比原植株0.08171%高70.48%；丹参酮ⅠA平均含量为0.3155%，比原植株0.2060%高53.16%，3种丹参酮平均含量为0.956%，比原植株0.4529%高112%。
综上所述，四倍体新品系61-2-22不仅田间农艺性状好，生长势旺，而且根部药材的丹参酮含量也大大高于原植株和其他四倍体株系。通过6年多来的试验研究证明应用组织培养技术进行丹参多倍体诱导育种，方法可行，技术先进，为药用植物育种研究开辟了新途径，在组织培养条件下人工诱导多倍体具有方法简便、处理植株量大，诱变效率高及繁殖速度快的优点。选育出的61-2-22优良品系可进一步扩大试种、培育使之成为丹参新品种供生产上大量推广使用。
药用植物中化学成分含量是一个重要指标，根茎叶的巨大性及繁茂性与化学成分含量会有一定的矛盾，必须同时考虑，往往根茎叶巨大的类型生长很快，组织疏松，对化学成分的积累不利。从本研究结果看，所获得的20多个多倍体品系中，绝大部分多倍体品系生长很快，根茎叶粗大、繁茂，但是化学成分含量不高，只有61-2-22根茎叶不是太大，属于丛根型、多根型的多倍体变异。因此产量高的同时化学成分含量也高，达到理想的要求。由此可见，多倍体诱导成功只是多倍体育种的第一步，更重要的是能从多种类型变异中选出我们所要求的类型，因此尽可能多地诱导获得多倍体株系可以为获得理想类型提供较大的选择可能性。
(3)丹参的细胞培养与活性成分的产生 初步确定丹参愈伤组织中含有活性成分原儿茶醛和白花丹参的愈伤组织中含有多种二萜醌类化合物。随后日本的科学家对丹参细胞培养进行了较为详细的研究。1983年，曾报道丹参愈伤组织6个细胞系中仅细胞系A生产隐丹参酮和铁锈醇，而其他细胞系仅产生铁锈醇。H.Miyasaka等人1985年继续报道细胞系B生产铁锈醇受2，4-D和光照的影响，2，4-D的加入对细胞生长有促进作用但明显抑制铁锈醇的产生。继代培养33个月之后，从细胞系B获得了一个驯化细胞系，其生长仅需激动素，不需要2，4-D，但铁锈醇的产生没有像预期的那样在培养期间一直增加，只是在细胞生长的延迟期(0-4天)连续增加，之后则下降到较低水平，可是当在第12天(细胞生长达到静止期之前)加3%的蔗糖到培养基中时，铁锈醇的含量迅速增加，到第20天培养物中铁锈醇含量是对照的约8.7倍，这表明对于驯化细胞系蔗糖主要影响着铁锈醇的合成。另外，通过细胞团块选择法从细胞系A得到一个生产隐丹参酮和铁锈醇的细胞系A5，并建立了该株系的二阶段培养，首先A5在MS附加2，4-D0.1和KIN0.1培养液中培养20天，然后转到不含Fe-EDTA和2，4-D的MS附加KIN1的生产培养基中再培养16天，在生产培养基中A5的生长几乎完全被抑制，但却可以连续生产隐丹参酮和铁锈醇并有一部分释放到培养基中，这一结果表明利用固定化A5细胞生产隐丹参酮和铁锈醇的潜力。固定化A5细胞培养在生产培养基中，25天期间隐丹参酮和铁锈醇的总含量连续增加，第25天收获时，前者大约74%被释放到培养基中，而后者仅38%被释放到培养基中。固定化细胞连续培养的研究表明每隔10天更换新鲜培养基时，第二次收获的隐丹参酮的总产量约为第一次收获的44%，而第六次收获时仅为25%；每隔15天更换新鲜培养基时，第二次收获隐丹参酮的总产量就显著减少，铁锈醇的情况与此类似，其原因并不是固定细胞的死亡，可能是积累亲脂性代谢物引起的负反馈效应，这表明连续培养对生产隐丹参酮和铁锈醇不大合算。1987年，H.Miyasaka等详细研究了MS培养基中各种成分对丹参悬浮细胞培养生产隐丹参酮和铁锈醇的影响，结果表明蔗糖、氮源和硫胺素(VB1)是生产这些化合物所必需的，且磷酸盐、MnSO4和激动素表现出一些有益的影响，MS培养基所有其它成分被认为不必需甚至有抑制作用，据此设计了一种生产隐丹参酮的简化培养基，同时作者还讨论了隐丹参酮合成的可能机制。1991年，K.Shimomura等建立了丹参的不定根培养及其高产丹参酮的培养条件。不定根培养在B5附加IBA 0.5的液体培养基生长比较慢(8周增长20倍)，但丹参酮含量高，超过80毫克/克干重，是原植物根中丹参酮含量的6倍，其主要成分是隐丹参酮和丹参酮Ⅱ。陶璐璐等用海藻胶包埋丹参愈伤组织细胞，在LS附加KIN 0.1和NAA1的培养液中常温振荡培养一个月左右，培养液抽提物经TLC和HPLC分析表明该系统可连续分泌丹参的主要成分--丹参酮ⅡA和隐丹参酮。此外对丹参愈伤组织悬浮培养、海藻胶包埋条件、固定化细胞的稳定性及分泌产物的特征等方面进行了比较。 |
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农杆菌介导的丹参的转化 |
(1)丹参转化植物的获得 用发根农杆菌15834，LBA9402菌株和根癌农杆菌C58菌株感染丹参无菌苗，诱导出毛状根和冠瘿瘤。毛状根和冠瘿组织在无激素的培养基上于光照条件下分化出转化的丹参再生植物，再生植物无论在试管中还是移栽到土壤中其表现型均与对照植株存在明显差异。移栽实验表明，用发根农杆菌转化后的再生植物具有节间缩短、植株矮化、地下部须根发达等特征，而用根癌农杆菌转化后的再生植物C1株系生长旺盛，地上部分较原植物高大，根系发达，根产量和总丹参酮含量都高于原植物。这表明通过农杆菌转化系统有可能改良现有药材品质，提高药材产量。
(2)转化组织和器官培养与活性成分的产生 利用转化的组织和器官培养生产丹参中的活性成分是近年来丹参细胞培养的新增长点。1993年，用不同发根农杆菌菌株感染无菌苗建立了丹参的毛状根培养，HPLC分析表明不仅毛状根中而且培养基中也含有七个主要的丹参酮和铁锈醇，毛状根株系S9402培养在不含铵盐的MS培养液第12天添加蔗糖使浓度为3%，8天后收获，干重增加22倍，总丹参酮含量为43毫克/克干重，其中隐丹参酮20毫克/克干重。1995年，报道蜜环菌诱导子对毛状根积累和分泌丹参酮非常有效，诱导子处理3-4日后毛状根中总丹参酮含量接近生药水平，并向培养基中分泌红色色素达44毫克/升。1997年，报道丹参毛状根培养物经HPLC分析证实其中含有原儿茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B等水溶性酚酸类化合物，丹酚酸A的含量为0.15%干重，是生药的2.17倍。1995年，报道用根癌农杆菌感染丹参无菌苗获得冠瘿组织，冠瘿组织的生长和丹参酮的积累与基本培养基有关，B5和MS培养基有利于生长，而67-V和WP培养基则有利于丹参酮的合成，在培养过程中丹参酮能分泌到培养液中。1997年，报道了丹参冠瘿组织高产株系的选择和丹参酮的产生，结果表明在MS培养基上不能获得高产株系，67-V培养基则有利于选择出高产株系，为了长期保持高产株系的稳定，有必要在继代过程反复选择。此外，研究还表明液体静止培养和诱导子技术有利于丹参冠瘿组织高产株系的扩大培养，丹参酮含量可达生药的三倍以上。由于真菌诱导子作为一种有效的调控手段，在植物细胞培养中能促进多种次生代谢产物的积累，故得到广泛应用，并已深入到其作用机理的研究。计算机软件对蜜环菌诱导子浓度、诱导子的加入时间和处理的收获时间第三因素进行了同步研究。基本培养基采用67-V液体培养基。培养条件：(25±1)℃，黑暗，培养液pH为5.71。蜜环菌(Armillaria mellea Karst)诱导子的制备：称50克麦麸加水200毫升煮沸15分钟过滤取滤液，加入葡萄糖20克、KH2PO4 1.5克、VB1 10毫克、95%乙醇20毫升，加水定容至1升，分装10个500毫升三角瓶，高压灭菌后制成PDA液体培养基。蜜环菌的菌索0.5-1厘米接种到PDA液体培养基中，置25℃，黑暗，120r/分钟摇床上培养13天左右，待蜜环菌生长良好，形成球菌时收获，用双层纱布过滤，滤渣用匀浆器打碎，与滤液合并搅匀，再次过滤，将滤液搅匀分装到500毫升的三角瓶中，高压灭菌后，保存于25℃备用。在诱导子浓度范围的初步研究中，摇床转速为140r/分钟。将100毫升培养液加入500毫升圆底烧瓶中，每瓶接种量为470毫克，每个处理作5次重复，培养开始时加入不同浓度(0、100、200、300，单位：毫升/升)的蜜环菌诱导子，共培养23天收获培养物与培养液。在诱导子优化实验研究中，诱导子均配成适当浓度的母液，pH调为5.71，共作10个处理，每个处理重复3次，摇床转速为150r/分钟。将50毫升培养液加入250毫升三角瓶中，每瓶接种量为400毫克。给定的蜜环菌诱导子浓度为0-180毫升/升，诱导子的加入时间为0-27天，处理的收获时间为20-38天。收获时用双层纱布过滤，用滤纸吸干培养物表面水分，称取鲜重，然后置于70℃烘箱烘干至恒重，称取干重，用研钵磨成粉，留样待测丹参酮的含量。样品中丹参酮含量的测定采用紫外分光光度法。培养液用1/10培养液体积的氯仿萃取，保留氯仿层，为了使细胞碎片与氯仿分层，可采用4000r/分钟离心20分钟。等氯仿挥干后称重，或直接稀释成适当浓度后在270nm处测吸光度，计算丹参酮的含量。蜜环菌诱导子对丹参冠瘿组织Ca株系的生长具有明显的抑制作用，且随着浓度的增加对Ca株系生长的抑制作用加强，而蜜环菌诱导子对丹参酮的积累与分泌具有促进作用，但并非浓度越高越好。由本实验可知，浓度100毫升/升的蜜环菌诱导子对培养物生长的抑制作用较小，且明显促进了丹参酮的积累与分泌，表明蜜环菌诱导子最佳浓度可能在100毫升/升左右。为了确保最佳浓度在实验范围内，并从对培养物生长的抑制和对丹参酮积累的促进两方面综合考虑，进行蜜环菌诱导子优化实验研究时采用的蜜环菌诱导子浓度范围是0-180毫升/升。
综上所述，利用丹参的组织培养改良丹参品质、提高丹参产量以及通过丹参组织、器官培养直接获得丹参的有效成分等诸方面均取得了令人鼓舞的进展。由于农杆菌转化技术和诱导子技术的运用，通过丹参组织和器官的大规模培养获得丹参的活性成分将具有良好的开发应用前景。
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